本测试盒用直接竞争免疫分析法定量测定河豚鱼中的河豚毒素（TTX）。该测试盒反应孔可拆卸，可测单份样品，也可测多份样品。定量分析时需有含450nm波长的微孔板酶标仪。

1 概要

河豚鱼是近海底栖居的肉食性有毒海产鱼类，其内脏有剧毒。其毒性物质主要是河豚毒素，河豚毒素是一种剧烈的神经毒素，其性质稳定，加热、盐腌及高温烹煮均不能使其破坏，其毒性比氰化钠大1000倍。因误食或食用加工不当的河豚鱼而发生人畜中毒的事件每年都有发生。故准确检测河豚鱼中的河豚毒素对预防和控制河豚毒素中毒，具有重要意义。本检测方法具有灵敏、快速、简便、特异性好、取样量小、不破坏鱼体结构，并可同时检测大量样品等优点。

2 测定原理

本测试盒利用固相酶联免疫吸附原理，采用直接竞争ELISA法进行测定。用抗原包被微孔板，加入河豚毒素标准品或样品、抗河豚毒素酶标单克隆抗体进行免疫反应后，加入底物显色，终止液终止后，用酶标仪在450nm处测定OD值。

3 提供的物品

微孔板

5个浓度的TTX标准溶液（各1mL）

标准1：0ng/mL    ……………………………………………………………直接使用

标准2：5.0ng/mL ……………………………………………………………直接使用

标准3：20.0ng/mL       ………………………………………………………直接使用

标准4：50.0ng/mL       ………………………………………………………直接使用

标准5：200.0ng/mL     ………………………………………………………直接使用

抗TTX抗体溶液(6mL)       ………………………………………………………直接使用

显色液(12mL)       …………………………………………………………………直接使用

终止液(6mL)  ………………………………………………………………………直接使用

浓缩洗液(30mL)   …………………………………………………………………稀释使用

4 盒中未提供，需自备物品

微孔板酶标仪（含450nm）、振荡器、粉碎机、微量移液器

量筒、漏斗、容量瓶、快速定性滤纸

乙酸、甲醇（分析纯）、去离子水或蒸馏水

5 操作者注意事项

       标准溶液中含有TTX毒素，应特别小心。

终止液为1N硫酸，避免接触皮肤。

每次加样后立即将所有试剂放回2~8 ℃。

每步加样时间应控制在5min内。

孵育过程中应避光。

不要使用过期试剂盒。

       不要交叉使用不同批号的试剂盒中的试剂。

6 储存条件

       保存试剂盒于2~8℃。不要冷冻

       显色液对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

       将不用的微孔板放进原铝箔袋中，置2~8℃保存。

7 试剂变质的标志

       标准1的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。

8 样品处理

----样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存；

----称取5g河豚鱼样品(肌肉、皮或内脏)，剪碎，组织匀浆器打碎，加入25mL 0.1%的乙酸，在电炉上煮沸搅拌10min。

----待冷却至室温后，3000rpm离心10min。

----上清用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中。

----沉淀加入20mL0.1% 乙酸，再煮沸3min，重复步骤3~4。

----加入等体积乙醚脱脂，静置分层，放出水层至另一分液漏斗中，再重复脱脂1次。

----将水层放入50mL量筒中，用0.1%乙酸定容至40mL，4℃保存备用。

----测定时取1mL提取液，用1mol/L氢氧化钠调节pH至6.5-7.0，立即用于检测。

9 酶免疫分析程序

----浓缩洗液为10倍浓缩液，使用时与去离子水或蒸馏水按体积比1:9稀释后使用。

       ----取所需数量的板条插入微孔架，记录样品及标准的位置。

       ----加入50mL标准品或处理好的样品到微孔，每个标准和样品必须使用新的吸头。

----加入50mL抗TTX抗体溶液到每个微孔（注意移液器管尖不要接触到孔中的液体，避免交叉污染）中，37℃孵育90min。

----甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板3min×3次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。

    ----每孔加入显色液100mL（2滴），37℃孵育10min。

    ----每孔加入终止液50mL（1滴），立即用酶标仪在波长450nm处测定吸光度值（OD值）。

10 样品浓度计算

以标准溶液OD值与标准1OD值的比值为纵坐标，所对应标准溶液浓度（ng/mL）的对数值为横坐标，制作校正曲线。根据样品OD值与标准1OD的比值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为TTX浓度的对数值，求得反对数即为测定液中TTX浓度C（ng/mL），按下列公式计算出样品中TTX含量：

TTX含量（mg/kg）= C×K

式中：C：稀释后样品提取液中TTX含量（ng/mL）

            K：样品稀释倍数（本提取方法为8）

11 主要技术指标及参数

11.1  最低检出浓度5.0 ng/mL。

11.2  加标回收率在70-120%，条内变异系数＜10%，条件变异系数＜15%。

11.3  线性范围：5.0~200.0ng/ml。

附图（仅供参考）

TTX浓度（ng/mL）对数值

                               TTX校正曲线